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山口大学遺伝子実験施設

BigDye® XTerminator精製キットについて

このほど、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit専用の シークエンス反応後、dye除去精製キットが発売になりました。
このキットは、反応済みのサンプルに試薬を添加して攪拌、遠心と 比較的簡単な操作で精製が可能です。
この精製法は、シグナルも強く初めて実験される方でも 安定した結果を得ることができます。

山口大学遺伝子実験施設でもこの精製キットの対応を開始しました。

遺伝子実験施設で行う実験方法は、以下の方法になります。

例：
BigDyeTerminator3.1を1/4量と5xBufferを用いて反応ボリューム20μlでシーケンス反応を行った場合。

  1. 0.2mlPCRチューブを使用します。
  2. シークエンス反応済みサンプル20μlに以下の試薬を添加
    • 反応済みサンプル　 20μl
    • ＋ SAM溶液　　　　90μl
    • ＋ XTerminator溶液20μl※１
    • Total 130μl
  3. ボルテックスミキサーで30分間撹拌※2
    • プレートベースまたはチューブラックに0.2mlチューブをのせ、上からテープで固定します。
  4. 1000xg回転で2分間　室温で遠心
  5. 上清を新しい0.2mlチューブに分取し（最低40μl以上）、冷蔵保存
  6. 保冷剤を加えたアイスボックスに入れ、遺伝子実験施設に提出
    • （アイスボックスと保冷剤返却します）

※１広径チップを使用します。 通常のチップでは径が細すぎるためXTerminator Solutionのビーズが 十分通過できず水分を多く吸収します。
　ABIでは、以下の商品を推奨しています。(商品番号ABI-JP758)

※2回転直径4mm,2000rpm以上のボルテックス本体および プレート固定用のアダプターを使います。
　回転数の設定できないボルテックスは、ボルテックススピードを最大にして行ってください。
　機器によってはオーバーヒートによる故障が発生する事が ありますのでご注意下さい。

注意点：

  1. ボルテックスミキサーによる攪拌時は必ず0.2mlチューブ または96wellプレートをお使い下さい。
    • 1.5mlチューブ等は攪拌効率が変わってくるため、 シグナルの低下、精製不良等の問題を生じます。
  2. 遠心分離を行わなくてもシークエンスを行うことは可能ですが、 確実に反応を止めるために遠心操作を行うことを推奨します。
    • 大量のサンプルなどで遠心操作を行わない場合は、その旨連絡ください。
  3. 精製した反応物は室温で48時間、4℃で10日間安定です。 必ず、冷蔵保存してください。
    特に吉田地区からサンプルを提出される場合は、 金曜日など休前日の提出はご遠慮ください。
    （BDX以外の精製は休前日でも大丈夫です）
  4. サンプルが多数で96ウェルプレートでサンプル提出を 希望される場合は、別途ご相談下さい。(内線2184)

BigDyeXTerminator精製キットの製品概要, 詳細な精製プロトコールはApplied Biosystems社下記サイトを
参照して下さい。

http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/modelpage.jsp?MODELCD=110717&MODELPGCD=110729
http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/modelpage.jsp?MODELCD=110717&MODELPGCD=110733

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